Épigénome spatial

Nature volume 616, pages 113–122 (2023)Citer cet article

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Les technologies spatiales émergentes, y compris la transcriptomique spatiale et l'épigénomique spatiale, deviennent des outils puissants pour le profilage des états cellulaires dans le contexte tissulaire1,2,3,4,5. Cependant, les méthodes actuelles ne capturent qu'une seule couche d'informations omiques à la fois, excluant la possibilité d'examiner la relation mécaniste à travers le dogme central de la biologie moléculaire. Ici, nous présentons deux technologies pour le profilage conjoint spatialement résolu, à l'échelle du génome, de l'épigénome et du transcriptome en coséquençant l'accessibilité de la chromatine et l'expression génique, ou les modifications d'histones (H3K27me3, H3K27ac ou H3K4me3) et l'expression génique sur la même section de tissu à une résolution quasi unicellulaire. Celles-ci ont été appliquées au cerveau de souris embryonnaire et juvénile, ainsi qu'au cerveau humain adulte, pour cartographier comment les mécanismes épigénétiques contrôlent le phénotype transcriptionnel et la dynamique cellulaire dans les tissus. Bien que des caractéristiques tissulaires hautement concordantes aient été identifiées par l'épigénome spatial ou le transcriptome spatial, nous avons également observé des modèles distincts, suggérant leurs rôles différents dans la définition des états cellulaires. Lier l'épigénome au transcriptome pixel par pixel permet de découvrir de nouvelles informations sur l'amorçage épigénétique spatial, la différenciation et la régulation des gènes au sein de l'architecture tissulaire. Ces technologies présentent un grand intérêt pour les sciences de la vie et la recherche biomédicale.

La multiomique unicellulaire permet de découvrir les mécanismes de régulation des gènes à travers différentes couches omiques6,7,8,9 mais manque d'informations spatiales, ce qui est crucial pour comprendre la fonction cellulaire dans les tissus. L'épigénomique spatiale, la transcriptomique et la protéomique sont apparues récemment1,2,3,4,5 mais la plupart d'entre elles ne peuvent capturer qu'une seule couche d'informations omiques. Bien que les méthodes informatiques puissent intégrer des données provenant de plusieurs omiques10, elles ne peuvent pas facilement découvrir les liens mécanistes entre les différentes couches omiques. Auparavant, nous avons développé un code-barres déterministe dans les tissus pour le séquençage en omique spatiale pour la co-mesure spatialement résolue du transcriptome et d'un panel de protéines1, et récemment, il a également été réalisé dans la plateforme 10X Visium11. Ici, pour étudier plus avant les mécanismes épigénétiques sous-jacents à la régulation de l'expression génique, nous avons développé une cartographie spatialement résolue et pangénomique de l'épigénome et du transcriptome par profilage simultané de l'accessibilité de la chromatine et de l'expression de l'ARN messager (analyse spatiale de la chromatine et de l'ARN accessibles à la transposase utilisant le séquençage (spatial ATAC-ARN-seq)), ou des modifications d'histones et de l'expression de l'ARNm (analyse spatiale du clivage sous les cibles et de la tagmentation et de l'ARN utilisant le séquençage (spatial CUT&Tag-ARN-s eq); appliqué aux modifications d'histones H3K27me3, H3K27ac ou H3K4me3) sur la même coupe de tissu au niveau cellulaire via un cobarcoding déterministe, pour intégrer la chimie de spatial-ATAC-seq3 ou spatial-CUT&Tag2 avec celle de la transcriptomique spatiale. Nous avons appliqué ces techniques au cerveau embryonnaire et juvénile de souris, ainsi qu'à l'hippocampe du cerveau humain adulte, pour disséquer les états épigénétiques et transcriptionnels et leur rôle dans la régulation de la dynamique des types cellulaires dans les tissus. Ces travaux ouvrent de nouvelles frontières en spatial-omique et peuvent offrir des opportunités sans précédent à la recherche biologique et biomédicale.

L'ATAC spatial – ARN-seq est représenté schématiquement sur la Fig. 1a et les données étendues sur les Fig. 1a – c. Une section de tissu congelé a été fixée avec du formaldéhyde et traitée avec un complexe de transposition Tn5 préchargé avec un adaptateur d'ADN contenant un lieur de ligature universel qui peut être inséré dans des loci d'ADN génomique accessibles à la transposase. La même section de tissu a ensuite été incubée avec un adaptateur d'ADN biotinylé contenant un lieur de ligature universel et une séquence poly-T qui se lie à la piste poly-A des ARNm pour initier la transcription inverse (RT) dans le tissu. Une puce de réseau de canaux microfluidiques a ensuite été placée sur la section de tissu pour introduire des codes-barres spatiaux Ai (i = 1-50 ou 100) qui ont été conjugués de manière covalente au lieur de ligature universel via une ligature modélisée. Ensuite, une autre micropuce avec des microcanaux perpendiculaires à la première direction d'écoulement a été utilisée pour introduire des codes-barres spatiaux Bj (j = 1-50 ou 100) qui ont ensuite été liés aux codes-barres Ai (i = 1-50 ou 100), résultant en une grille bidimensionnelle de pixels de tissu à code-barres spatial, chacun défini par la combinaison unique des codes-barres Ai et Bj (i = 1-50 ou 100, j = 1-50 ou 100 ; pixels à code-barres, n = 2 500 ou 10 000). Enfin, des fragments d'ADN complémentaire et d'ADN génomique à code-barres ont été libérés après réticulation inverse. Les ADNc ont été enrichis avec des billes de streptavidine et des fragments d'ADNg ont été retenus dans le surnageant. Les bibliothèques d'ADNg et d'ADNc ont été construites séparément pour le séquençage de nouvelle génération (NGS). Le CUT&Tag spatial – RNA-seq a été réalisé en appliquant un anticorps contre une modification d'histone spécifique (H3K27me3, H3K27ac ou H3K4me3) à la section de tissu, puis en utilisant un complexe Tn5-ADN lié à la protéine A pour effectuer le CUT&Tag. Les étapes restantes étaient similaires à celles de l'ATAC-ARN-seq spatial (Fig. 1a et données étendues Fig. 1a, d, e), mais ont abouti à un co-profilage spatial de l'occupation et du transcriptome de la modification des histones à l'échelle du génome.

a, flux de travail schématique. b, Comparaison du nombre de fragments uniques et de la fraction de lectures dans les pics (FRiP) dans l'ATAC-ARN-seq spatial et le CUT&Tag-ARN-seq spatial. c, distribution du nombre de gènes et d'UMI dans l'ATAC-ARN-seq spatial et le CUT&Tag-ARN-seq spatial. Nombre de pixels dans E13, 2 187 ; dans le cerveau humain, 2 500 ; dans le cerveau de souris (ATAC), 9 215 ; dans le cerveau de souris (H3K27me3), 9 752 ; dans le cerveau de souris (H3K27ac), 9 370 ; dans le cerveau de souris (H3K4me3), 9 548. Les boîtes à moustaches montrent la médiane (ligne médiane), les premier et troisième quartiles (limites de la boîte) et 1,5 × plage interquartile (moustaches). d, distribution spatiale et UMAP de tous les clusters pour l'ATAC, l'ARN et le regroupement conjoint des données ATAC et ARN. La superposition des clusters avec l'image des tissus montre que les clusters spatiaux correspondent précisément aux régions anatomiques. Taille de pixel, 50 µm ; barres d'échelle, 1 mm. e, Cartographie spatiale de GAS et expression génique pour des gènes marqueurs sélectionnés dans différents groupes pour ATAC et ARN dans ATAC – ARN-seq spatial. f, analyse pseudo-temporelle de la glie radiale aux neurones prématurés postmitotiques visualisés au niveau spatial. g, Heatmaps délimitant l'expression des gènes et GAS pour les gènes marqueurs. h, Changements dynamiques du GAS et de l'expression des gènes à travers le pseudo-temps.

Nous avons effectué des expériences spatiales ATAC – RNA-seq sur des embryons de souris au jour 13 (E13) (taille de pixel, 50 μm), des cerveaux de souris au jour postnatal 21/22 (P21/22) (taille de pixel, 20 μm) et des tissus d'hippocampe de cerveau humain adulte (taille de pixel, 50 μm). Pour la taille de pixel de 50 μm, nous avons obtenu une moyenne de 25 cellules pour l'embryon de souris E101 et entre une et neuf cellules pour l'hippocampe humain3. La plupart des pixels de 20 μm contenaient une à trois cellules par pixel dans le cerveau de souris juvéniles (Fig. 1b supplémentaire). À l'aide d'un schéma de codes à barres de 100 × 100, la zone de cartographie couvre presque tout l'hémisphère d'une section coronale de cerveau de souris P22. À partir de cet échantillon, nous avons obtenu une médiane de 14 284 fragments uniques par pixel, dont 19 % étaient enrichis dans les régions du site de début de la transcription et 26 % situés dans les pics (Fig. 1b et Fig. 1a et 2a supplémentaires). Pour la partie ARN, un total de 22 914 gènes ont été détectés, avec une moyenne de 1 073 gènes et 2 358 identifiants moléculaires uniques (UMI) par pixel (spatial ATAC – RNA-seq) (Fig. 1c). Nous avons effectué un CUT&Tag–RNA-seq spatial pour H3K27me3, H3K27ac et H3K4me3 sur des cerveaux de souris P21/22 (taille de pixel, 20 μm). Avec le dispositif de code-barres 100 × 100, nous avons obtenu une médiane de 10 644 (H3K27me3), 10 002 (H3K27ac) et 2 507 (H3K4me3) fragments uniques par pixel, dont 12 % (H3K27me3), 17 % (H3K27ac) et 67 % (H3K4me3) chevauchaient les régions du site de début de transcription et 12 % (H3K27me3), 21% (H3K27ac) et 54% (H3K4me3) étaient respectivement localisés dans les pics (Fig. 1b et Fig. 1a et 2a supplémentaires). Pour les données ARN, 25 881 (H3K27me3), 23 415 (H3K27ac) et 22 731 (H3K4me3) gènes ont été détectés avec une moyenne de 2 011 (H3K27me3), 1 513 (H3K27ac) et 1 329 (H3K4me3) gènes par pixel (4 734 (H3K27me 3), 3 580 (H3K27ac) et 2 885 (H3K4me3) UMI par pixel, respectivement (Fig. 1c)). L'évaluation de la qualité des données pour l'embryon de souris, le cerveau de souris P21 et les échantillons de cerveau humain avec des codes à barres 50 × 50 est également incluse dans les Fig. 1b, c, Figs supplémentaires. 1a et 2a–c et tableaux supplémentaires 2 et 3.

De plus, les distributions de taille d'insert des fragments d'accessibilité de la chromatine (ATAC-ARN-seq spatial) et de modification des histones (CUT & Tag-ARN-seq spatial, H3K27me3, H3K27ac ou H3K4me3) étaient cohérentes avec les fragments nucléosomiques capturés dans tous les tissus (Fig. 1c, d supplémentaire). L'analyse de corrélation entre les répliques a montré une reproductibilité élevée (r = 0, 98 pour ATAC, r = 0, 98 pour l'ARN dans l'ATAC spatial – ARN-seq, r = 0, 96 pour CUT & Tag (H3K27ac), r = 0, 89 pour l'ARN dans l'espace CUT & Tag – ARN-seq; r désigne le coefficient de corrélation de Pearson; Fig. 2d, e supplémentaire). Le type, la préparation et la qualité des tissus peuvent tous influencer les mesures analytiques (méthodes).

L'ATAC-ARN-seq spatial sur l'embryon de souris E13 a identifié huit groupes ATAC majeurs et 14 groupes d'ARN, suggérant qu'à ce stade de développement, l'accessibilité à la chromatine peut ne pas permettre la discrimination de tous les types de cellules définis par les profils transcriptionnels. La distribution spatiale de ces grappes est en accord avec l'histologie des tissus (voir la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine d'une coupe de tissu adjacente sur la Fig. 1d et les données étendues sur la Fig. 2a). Dans les données ATAC, le groupe A3 représente le champ oculaire embryonnaire avec une accessibilité ouverte à la chromatine au niveau des locus de gènes, y compris Six6 (Fig. 1d (à gauche) et Fig. 1e). Les groupes A4-A5 sont associés à plusieurs organes internes en développement. Les clusters A6-A7 couvrent le système nerveux central (SNC). Pour comparer le résultat ATAC, nous avons agrégé les profils d'accessibilité de la chromatine en pixels dans des organes spécifiques et les avons comparés aux données de référence ENCODE E13.5 ATAC-seq spécifiques à l'organe (Fig. 3b supplémentaire). De plus, les pics obtenus à partir de nos données spatiales ATAC sont également cohérents avec la référence ENCODE (Fig. 3c supplémentaire). Nous avons intégré les données ATAC spatiales aux données ARN-seq12 unicellulaires pour l'attribution du type de cellule dans chaque cluster (données étendues Fig. 2c, d). Comme prévu, la glie radiale (cellules souches / progénitrices neurales) a été observée principalement dans la couche ventriculaire, et des types cellulaires différenciés tels que les neurones prématurés postmitotiques et les interneurones inhibiteurs ont été enrichis dans les régions éloignées de la couche ventriculaire (données étendues Fig. 2d).

Des gènes marqueurs spécifiques au type de cellule ont été identifiés pour des grappes individuelles et leur expression a été déduite de l'accessibilité de la chromatine (Fig. 1e et Données étendues Fig. 2b, e) et prédite par le score d'activité génique (GAS13; Méthodes). Sox2, qui est impliqué dans le développement du tissu nerveux et la formation du nerf optique14,15, a montré une accessibilité élevée à la chromatine dans le champ oculaire embryonnaire et dans la couche ventriculaire contenant des cellules souches/progénitrices neurales. Pax6 présentait un modèle spatial similaire d'accessibilité à la chromatine. Myt1l, qui code pour la protéine de type 1 du facteur de transcription de la myéline, a présenté un signal ATAC plus élevé dans le cerveau embryonnaire et le tube neural16. Six6, un gène clé impliqué dans le développement de l'œil17, a montré le GAS le plus élevé dans la région de l'œil. Nrxn2, qui code pour la Neurexine 2, un gène clé du système nerveux des vertébrés18, était largement accessible dans la plupart des régions des cellules neurales. L'accessibilité à Rbfox3, qui code pour l'homologue 3 de la protéine de liaison à l'ARN fox-1 (un facteur d'épissage connu sous le nom de NeuN) 19 , a été observée dans les neurones 19 alors que Sox1 et Sox2 présentaient une accessibilité de la chromatine enrichie dans la couche ventriculaire (Fig. 1e et Extended Data Fig. 2b). L'enrichissement spécifique au type de cellule des régulateurs du facteur de transcription (TF) a également été examiné à l'aide de l'analyse ChromVAR20 de la déviation des motifs TF (Sox2 et Nfix) et a identifié les régulateurs TF positifs (Extended Data Fig. 2g, h). Nous avons observé que le motif Sox2 était enrichi dans le cluster A7, conformément à sa fonction dans le développement du cerveau embryonnaire21. L'analyse GREAT22 a en outre vérifié la forte concordance entre les voies de régulation des gènes et l'annotation anatomique (Extended Data Fig. 2i, j).

Pour les données spatiales d'ARN, 14 groupes distincts ont été identifiés et caractérisés par des gènes marqueurs spécifiques (Fig. 1d (milieu) et Données étendues Fig. 2f). Par exemple, le groupe R10 (Six6) était corrélé à l'œil embryonnaire, les groupes R2, R6 et R8 étaient liés au SNC et le groupe R7 était associé à la formation de cartilage. Pour évaluer la qualité des données, nous avons effectué une analyse de corrélation avec les données de référence ENCODE E13.5 RNA-seq spécifiques à l'organe, qui ont montré une concordance élevée (Fig. 3a supplémentaire). Des gènes marqueurs spécifiques au type de cellule ont également été identifiés pour des grappes d'ARN individuelles - par exemple, Mapt (R2) peut fonctionner dans l'établissement et le maintien de la polarité neuronale23. Epha5 (R6) est impliqué dans le guidage axonal, tandis que Slc1a3 (R8) est impliqué dans la régulation de la neurotransmission excitatrice dans le SNC18. Myh3 (R3) est associé à la contraction musculaire24. Col2a1 (R7), qui présente une expression spécifique dans les tissus cartilagineux, joue un rôle essentiel dans le développement normal du squelette embryonnaire18. Les résultats de l'analyse des voies25 concordent avec l'annotation anatomique (Fig. 4a supplémentaire).

L'intégration des données d'ARN spatiales avec les données d'organogenèse de souris scRNA-seq12 a été réalisée pour déterminer les identités cellulaires dans chaque pixel (données étendues Fig. 2c, d). Nous avons observé que la glie radiale, les neurones prématurés postmitotiques et les interneurones inhibiteurs (clusters R8, R6 et R2) étaient présents dans les mêmes clusters majeurs, comme indiqué dans l'analyse ATAC (clusters A7 et A6), qui a vérifié l'utilisation de plusieurs informations omiques pour une identification plus robuste du type de cellule. Nous avons tenté un regroupement conjoint des données spatiales ATAC et ARN pour affiner les modèles spatiaux. Un nouveau cluster neuronal (J10) a été identifié dans l'analyse de clustering conjointe, qui n'a pas été facilement résolu par des modalités uniques seules (Fig. 1d, à droite). Ce résultat met en évidence la valeur de l'utilisation de profils multiomiques conjoints pour améliorer la cartographie spatiale des types de cellules26.

Le co-profilage de l'épigénome et du transcriptome facilite l'étude de la corrélation entre les pics accessibles et les gènes exprimés pixel par pixel dans le contexte tissulaire. Nous avons observé des signaux distincts au niveau des amplificateurs prédits pour certains gènes (Sox2, Pax6 et Sox1) (données étendues Fig. 2e et Fig. 4b supplémentaire). Par exemple, les amplificateurs pour Sox2 et Pax6 avaient une accessibilité plus élevée à la chromatine dans les groupes A7 et A3, respectivement, suggérant leurs rôles dans ces régions tissulaires dans la régulation de l'expression de Sox2 et Pax6. Bien que la distribution spatiale de l'ARN de ces gènes corresponde à leur accessibilité à la chromatine, le niveau d'expression peut différer considérablement du degré d'accessibilité (Fig. 1e et Extended Data Fig. 2b). Certains gènes marqueurs (Pax6, Sox2 et Myt1l) étaient hautement accessibles dans certaines régions du cerveau embryonnaire, mais présentaient une expression d'ARN modeste ou faible (Fig. 1e et Extended Data Fig. 2b), ce qui peut indiquer un amorçage de la lignée10,27 de ces gènes dans le développement du cerveau embryonnaire. Malgré une forte corrélation entre les répliques (Fig. 2d supplémentaire), cette observation pourrait être due en partie à la profondeur de séquençage et à la sensibilité de détection de l'ARN. Néanmoins, ces résultats mettent encore en évidence le potentiel de lier la régulation épigénétique à l'échelle du génome à la transcription dans le contexte tissulaire spatial.

Pour étudier la relation spatio-temporelle entre l'accessibilité de la chromatine et l'expression des gènes dans le développement embryonnaire, nous avons analysé la trajectoire de différenciation de la glie radiale à divers types de neurones tels que les neurones prématurés postmitotiques28. L'analyse pseudo-temporelle29 a été réalisée sous le système de coordonnées pseudo-temporelles ATAC et les trajectoires de développement ont été directement visualisées sur la carte spatiale des tissus (Fig. 1f). L'accessibilité de la chromatine GAS et l'expression des gènes le long de cette trajectoire ont montré des changements dynamiques dans les gènes marqueurs sélectionnés (Fig. 1g, h). Comme prévu, les niveaux d'expression de Sox2, Pax6 et d'autres gènes impliqués dans le maintien et la prolifération des progéniteurs (Gene Ontology (GO) Fabp7 à Pax6 dans Extended Data Fig. 3a) ont été régulés à la baisse lors de la transition vers les neurones postmitotiques. La perte d'accessibilité à la chromatine au niveau des loci Pax6 et du marqueur glial radial Fabp7 a précédé la régulation à la baisse des ARN correspondants (Fig. 1h). À leur tour, les gènes impliqués dans l'identité neuronale, l'axonogenèse et l'organisation des synapses (GO Myt1l à Dnm3 dans Extended Data Fig. 3a), tels que Dcx et Tubb3, ont montré une expression accrue en pseudo-temps spatial, mais l'accessibilité de la chromatine à leurs loci était déjà élevée à des stades antérieurs, suggérant l'amorçage de la lignée de ces gènes dans l'expression10,27. Nous avons également trouvé une cohorte de gènes dont l'expression déclinait rapidement pendant le pseudo-temps spatial mais dont l'accessibilité à la chromatine était maintenue tout au long du pseudo-temps ou ne déclinait qu'à des stades très tardifs. Beaucoup de ces gènes, tels que Ptprz1, Bcan et Luzp2, sont caractéristiques des cellules précurseurs des oligodendrocytes, et les processus biologiques GO correspondants sont la régulation négative de la myélinisation et la régulation de la gliogenèse (GO Cp à Sparcl1 dans Extended Data Fig. 3a), suggérant que la lignée neuronale pourrait conserver le potentiel d'acquérir une identité d'oligodendrocyte même lorsqu'elle a déjà migré hors de la zone ventriculaire dans le cerveau embryonnaire. L'analyse en pseudo-temps de Monocle2 a montré une bifurcation dans l'accessibilité de la chromatine mais pas dans l'expression de l'ARN ; un chemin menait à des régions proches de la zone ventriculaire (pixels verts, données étendues Fig. 3d, e) et l'autre se terminait dans des régions distales à la zone ventriculaire (pixels bleus). Contrairement à la voie verte, la voie bleue a présenté une augmentation de l'accessibilité de la chromatine pour les gènes impliqués dans l'axonogenèse et la formation de dendrites (données étendues Fig. 3e (encadré rouge), 3f), suggérant que l'état de la chromatine des cellules neurales distales du ventricule correspond à un état neuronal plus différencié. Ainsi, notre spatial ATAC – RNA-seq peut être utilisé pour déchiffrer le mécanisme de régulation des gènes et la dynamique spatio-temporelle au cours du développement tissulaire.

Nous avons développé une micropuce avec 100 microcanaux serpentins pour coder à barres 100 × 100 ou, au total, 10 000 pixels par section de tissu et jusqu'à cinq échantillons par puce (Fig. 2a, taille de pixel de 20 μm). Cela a été appliqué à des coupes coronales de cerveau de souris P22 (au bregma 1) pour le profilage conjoint de l'accessibilité de la chromatine avec le transcriptome. Contrairement au cerveau embryonnaire de souris E13, nous avons trouvé un nombre plus élevé de grappes ATAC (14) par rapport aux grappes d'ARN (11), indiquant une différenciation terminale de la plupart des principaux types de cellules dans le cerveau juvénile par rapport à celle de l'embryon, qui se compose de nombreux états cellulaires indifférenciés ou multipotents. La distribution spatiale des grappes était en accord avec l'annotation anatomique définie par la coloration de Nissl, reflétant l'aréalisation du cerveau juvénile (Fig. 2b). De plus, les clusters spatiaux entre l'ATAC et l'ARN ont montré une concordance dans l'attribution des clusters (Fig. 5a supplémentaire). L'accessibilité à la chromatine des gènes marqueurs a identifié des régions majeures telles que le striatum (Pde10a et Adcy5, marqueurs des neurones épineux moyens, cluster A1), le corps calleux (Sox10, Mbp et Tspan2, marqueurs d'oligodendroglie, cluster A3), le cortex (Mef2c, Neurod6 et Nrn1, clusters A0 et A4, marqueurs des neurones excitateurs ; Cux2, cluster A4) et le ventricule latéral (Dl x1, Pax6, Notch1 et Sox2, marqueurs des cellules progénitrices épendymaires/neurales, groupe A11) (Fig. 2e et données étendues Fig. 4a, b). L'analyse GREAT a confirmé que les principales voies étaient corrélées aux fonctions tissulaires dans différentes régions anatomiques (Fig. 5b, c supplémentaires). Les clusters d'ARN spatiaux ont également montré une expression génique spécifique à la région, telle que le striatum (Pde10a, cluster R2, neurones épineux moyens), le corps calleux (Mbp et Tspan2, cluster R5, oligodendroglia) et le cortex (Mef2c, clusters R0 et R1, neurones excitateurs) (Fig. 2e et Extended Data Fig. 4a).

a, Conception de puces microfluidiques pour codes à barres 100 × 100 avec une taille de canal de 20 μm. b, Distribution spatiale et UMAP de tous les clusters pour l'ATAC et l'ARN dans l'ATAC-ARN-seq spatial du cerveau de souris. Taille de pixel, 20 µm ; barres d'échelle, 1 mm. c, Intégration des données ATAC et des données scATAC-seq30 du cerveau de souris. d, Intégration des données d'ARN et des données de scRNA-seq32 du cerveau de souris. e, Cartographie spatiale de GAS et expression génique pour des gènes marqueurs sélectionnés dans différents groupes pour ATAC et ARN dans ATAC – ARN-seq spatial. Une liste des définitions d'abréviations se trouve dans le tableau supplémentaire 1.

L'intégration des données de l'atlas cérébral de souris ATAC-seq à cellule unique30 avec les données spatiales ATAC-seq a facilité l'identification de tous les principaux types de cellules, et le transfert d'étiquettes a ensuite été utilisé pour attribuer des types de cellules à des emplacements spatiaux où l'état épigénétique peut contrôler la formation de types de cellules spécifiques (Fig. 2c et données étendues Fig. 4c). Par exemple, nous avons observé des oligodendrocytes immatures et des oligodendrocytes dans le cluster A3 correspondant au corps calleux. Une fine couche de cellules radiales de type glie a été trouvée dans le ventricule latéral, des neurones épineux moyens (D1MSN et D2MSN) dans le striatum et des neurones inhibiteurs dans le noyau septal latéral30 (Extended Data Fig. 4c) sur la base de l'accessibilité de la chromatine. De plus, les sous-classes de neurones excitateurs dans différentes couches du cortex (ITL23GL, Cortex L2/3 ; ITL4GL, Cortex L4 ; ITL5GL, Cortex L5 ; PTGL, Cortex PT ; NPGL, Cortex NP ; ITL6GL, Cortex L6 ; CTGL, Cortex CT ; et L6bGL, Cortex L6b) ont été clairement identifiées31 (Extended Data Fig. 4c). L'intégration des données spatiales de l'ARN et de l'atlas 32 scRNA-seq du SNC juvénile a permis la visualisation des types de cellules transcriptionnelles dominantes dans les tissus (Fig. 2d et Extended Data Fig. 4d). Nous avons observé un degré élevé de concordance dans la distribution spatiale des types de cellules, déterminée par l'ATAC par rapport à l'ARN, ce qui suggère une congruence générale entre l'accessibilité de la chromatine et le transcriptome dans la définition des identités cellulaires dans les tissus. Par exemple, les cellules progénitrices neuronales intermédiaires (SZNBL, incluses dans les cellules radiales de type gliale de scATAC-seq30), les oligodendrocytes matures (MOL, inclus dans les oligodendrocytes de scATAC-seq), les oligodendrocytes nouvellement formés (inclus dans les oligodendrocytes immatures de scATAC-seq) et les neurones épineux moyens (MSN) indiqués par les données d'ARN ont été enrichis dans les mêmes régions que celles identifiées par les données ATAC ( Données étendues Fig. 4c,d). De plus, la détection d'une fine couche de SZNBL dans le ventricule latéral et les cellules leptoméningées vasculaires (VLMC) dans les régions à méninges préservées a démontré une résolution spatiale élevée pour notre technologie dans l'identification des cellules à faible abondance, même à une résolution quasi unicellulaire (pour VLMC) (données étendues Fig. 4c, d).

Le profilage conjoint de l'ATAC et de l'ARN facilite la déduction du paysage de régulation des gènes en recherchant l'accessibilité maximale corrélée et l'expression des gènes. Nous avons détecté 21 417 liaisons pic-à-gène significatives entre les éléments régulateurs et les gènes cibles (données étendues Fig. 5c, d). Certains activateurs potentiels avec des interactions de promoteurs régulées dynamiquement se sont avérés enrichis dans des clusters spécifiques tels que Dlx1 et Sox2 (cluster A11), Tspan2 (cluster A3) et Adcy5 (cluster A1) (Extended Data Fig. 4b), indiquant la capacité de spatial ATAC – RNA-seq pour identifier les régions régulatrices clés des gènes cibles. Les modèles spatiaux d'enrichissement du motif TF (Dnajc21, Pax6, Sox2, Sox4 et Mef2c) ont fourni des informations supplémentaires sur les régulateurs TF33 visualisés dans les tissus (données étendues Fig. 5a, b). Par exemple, Sox2 a été examiné simultanément pour l'accessibilité de la chromatine, l'expression des gènes, les activateurs putatifs et l'enrichissement du motif TF, permettant une compréhension plus complète de la dynamique de la régulation des gènes. Comme observé dans le cerveau embryonnaire de la souris, certains gènes marqueurs à accessibilité ouverte à la chromatine (Sox10, Sox2, Neurod6, Pax6 et Notch1) n'étaient pas ou peu exprimés (Fig. 2e et Extended Data Fig. 4a). Une expérience biologique répliquée sur le cerveau de souris P21 a également été réalisée (Extended Data Fig. 6; taille de pixel de 20 μm, codes à barres 50 × 50). Beaucoup de ces gènes codent pour des facteurs de transcription impliqués dans le développement neuronal, suggérant la possibilité d'une mémoire épigénétique, mais pas transcriptionnelle, de ces gènes dans le développement du cerveau.

En plus de l'accessibilité de la chromatine, les modifications des histones sont également un aspect clé de la régulation épigénétique. Le CUT&Tag-RNA-seq spatial a été réalisé pour co-profiler les modifications d'histone H3K27me3 (locus de répression), H3K27ac (promoteurs d'activation et/ou activateurs) ou H3K4me3 (promoteurs actifs), respectivement, dans le cerveau de souris P22 (taille de pixel de 20 μm, codes à barres de 100 × 100). Nous avons identifié 13 et 15 clusters spécifiques pour H3K27me3 et l'ARN, 12 et 13 clusters pour H3K27ac et l'ARN et 11 et 12 clusters pour H3K4me3 et l'ARN, respectivement (Fig. 3a – c). Ces grappes concordaient avec l'annotation anatomique par coloration de Nissl et montraient une bonne concordance entre CUT & Tag et l'ARN dans les modèles spatiaux (Fig. 3a – c), ce qui a été confirmé par l'analyse Belayer34 (Fig. 7c supplémentaire).

a–c, distribution spatiale et UMAP de tous les clusters pour H3K27me3 et ARN (a), H3K27ac et ARN (b) et H3K4me3 et ARN (c) dans le cerveau de souris. Taille de pixel, 20 µm ; barres d'échelle, 1 mm. d, Intégration des données H3K27me3 avec les données scCUT&Tag (H3K27me3)37 du cerveau de souris. e, Intégration des données H3K27ac avec les données scCUT&Tag (H3K27ac)37 du cerveau de souris. f, Intégration des données d'ARN dans le CUT&Tag spatial (H3K27me3)–RNA-seq, le CUT&Tag spatial (H3K27ac)–RNA-seq et le CUT&Tag spatial (H3K4me3)–RNA-seq avec les données scRNA-seq32 du cerveau de souris.

Pour H3K27me3, l'expression génique a été prédite par le calcul du score de silençage de la chromatine (CSS2, 35 ; méthodes). Un CSS élevé indique une expression génique réprimée en raison de la fonction de répression transcriptionnelle de H3K27me3. Pour H3K27ac et H3K4me3, les gènes actifs doivent correspondre à un GAS2,13 élevé (Méthodes). Le regroupement de CSS ou de GAS basé sur différentes modifications a résolu toutes les principales régions tissulaires (Fig. 3a – c et Supplémentaire Fig. 6) et identifié des modifications de gènes marqueurs spécifiques à la région. Cux2 a montré un GAS élevé dans le cluster C9 (H3K27ac) et le cluster C6 (H3K4me3), indiquant un enrichissement des neurones excitateurs5. Cux2 a été observé dans les couches corticales 2/3, correspondant aux couches superficielles du cortex. En revanche, H3K27me3 était épuisé à Cux2 dans la même région (cluster C3) (Fig. 6 supplémentaire). Le GAS de Fezf2 (un gène marqueur pour la couche corticale 5) était élevé dans le cluster C8 (H3K27ac) et le cluster C7 (H3K4me3), correspondant à la couche plus profonde du cortex. Fezf2 a été épuisé pour H3K27me3 (cluster C1) dans cette couche. Satb2 a montré l'activité la plus élevée dans les clusters C8 et C9 (H3K27ac) et C6 et C7 (H3K4me3), mais le CSS le plus bas dans les clusters C1 et C3 (H3K27me3) dans la couche corticale. Tspan2 était enrichi en cluster C4 (H3K27ac) et en cluster C1 (H3K4me3) mais appauvri en cluster C5 (H3K27me3) dans le corps calleux, associé au développement de la lignée des oligodendrocytes (Fig. 6 supplémentaire). Les clusters d'ARN correspondants ont également montré des signatures concordantes spécifiques à la région (Fig. 3a – c et Fig. 6 supplémentaire), comme illustré par Cux2 dans les neurones excitateurs de la couche corticale 2/3 (cluster R5 (H3K27me3 apparié), cluster R5 (H3K27ac apparié) et cluster R6 (H3K4me3 apparié)), Fezf2 dans les neurones excitateurs de la couche corticale 5 (cluster R1 (H3K2 7me3 apparié), cluster R1 (H3K27ac apparié), cluster R1 (H3K4me3 apparié)), Tspan2 dans les cellules de la lignée des oligodendrocytes du corps calleux (cluster R4 (H3K27me3 apparié), cluster R4 (H3K27ac apparié) et cluster R3 (H3K4me3 apparié) Fig. 6 supplémentaire).

L'intégration et la co-intégration des données spatiales CUT&Tag et scCUT&Tag36,37 (Fig. 3d, e et données étendues Fig. 7a) ont montré que les états épigénétiques dans nos données pour H3K27me3, H3K27ac et H3K4me3 étaient en accord avec la projection correspondante dans scCUT&Tag. L'intégration avec l'atlas32 scRNA-seq juvénile correspondant du SNC a permis le transfert d'étiquettes pour attribuer des types de cellules transcriptionnelles à l'emplacement spatial des identités / états épigénétiques (données étendues Fig. 7g, h, en bas). Par exemple, nous avons observé un enrichissement en MOL dans le corps calleux, une fine couche de cellules épendymaires dans le ventricule latéral, des neurones excitateurs dans le cortex cérébral et des MSN dans le striatum. Nous avons également intégré des données d'ARN appariées avec l'atlas scRNA-seq32 pour identifier les types de cellules transcriptionnelles dominantes via le transfert d'étiquettes (Fig. 3f et Extended Data Fig. 7b – h). MOL, une fine couche de cellules épendymaires, MSN et neurones excitateurs ont été enrichis dans les mêmes régions spatiales identifiées par CUT & Tag (H3K27ac et H3K4me3) (données étendues Fig. 7g, h, en haut). En particulier pour H3K27me3 spatial, alors que l'intégration avec scCUT & Tag ne pouvait pas clairement montrer l'identité de plusieurs clusters dans les modalités épigénomiques (clusters C0, C1 et C3), le transfert d'étiquettes de données scRNA-seq avec des données d'ARN appariées provenant de la même coupe de tissu a clairement montré des identités cellulaires dans ces clusters (Fig. 3a, d et Données étendues Fig. 7f), soulignant la puissance de la combinaison de CUT & Tag et RNA-seq (CUT & Tag–RNA-seq) dans la même section de tissu pour identifier plus précisément les types ou états cellulaires. Pour déduire directement les interactions entre l'expression génique à l'échelle du génome et les amplificateurs correspondants dans tous les clusters, nous avons identifié un total de 19 468 liaisons pic-à-gène significatives à partir de CUT&Tag spatial (H3K27ac) – ARN-seq (Fig. 7a, b supplémentaires). Une réplique biologique a également été réalisée sur le cerveau de souris P21 (Extended Data Fig. 8; taille de pixel de 20 μm, codes à barres 50 × 50).

Pour mieux comprendre la régulation épigénétique spatiale de l'expression génique à l'échelle du génome, nous avons comparé le GAS ou le CSS obtenu à partir d'ATAC et de CUT & Tag (H3K27me3, H3K27ac et H3K4me3) avec l'expression d'ARN correspondante dans toutes les principales régions tissulaires du cerveau de souris P22 (Fig. 4a – c et Figs supplémentaires 9a, 10a et 11a). Par exemple, dans le corps calleux riche en oligodendrocytes, nous avons observé une anticorrélation robuste entre H3K27me3 et l'ARN (Fig. 4a). Des gènes tels que Mal, Mag et Car2 avec une faible expression de CSS et une forte expression d'ARN correspondent à des processus biologiques GO tels que la myélinisation et la régulation de la différenciation des oligodendrocytes (Données étendues Fig. 9a – c et Supplémentaire Fig. 8; GO pour le quadrant IV). En revanche, des gènes tels que Grin2b et Syt1 avec un CSS élevé et une faible expression d'ARN sont liés à des processus neuronaux tels que la transmission synaptique et la libération de neurotransmetteurs (Extended Data Fig. 9d, e et Supplementary Fig. 8; GO pour le quadrant II). Ces résultats sont conformes à l'analyse ATAC/H3K27me3/H3K27ac Nano-CUT&Tag37 de la différenciation oligodendrogliale dans le cerveau juvénile, qui a montré deux vagues de répression H3K27me3 au cours de ce processus37. Nous avons également trouvé un petit sous-ensemble de gènes (Fig. 4a et Supplémentaire Fig. 8; GO pour le quadrant I) avec des niveaux plus élevés de H3K27me3 et d'ARN dans le corps calleux, tels que Ptprz1, un marqueur de cellules précurseurs d'oligodendrocytes38,39 (Extended Data Fig. 9g), ce qui pourrait indiquer un équilibre transcriptionnel de certains de ces gènes. Cela pourrait également être dû en partie à la présence à proximité à la fois de cellules précurseurs d'oligodendrocytes (exprimant Ptprz1) et d'oligodendrocytes matures (où Ptprz1 est réprimé) dans le corps calleux. Nous avons effectué une analyse de corrélation similaire pour l'ARN et H3K27me3 dans d'autres régions du cerveau juvénile, y compris le striatum et les couches corticales superficielles et plus profondes (Figs. 9a, 10a et 11a supplémentaires). Nous avons également observé une forte anticorrélation avec une cohorte de gènes impliqués dans les processus neuronaux activés ou réprimés d'une manière spécifique à la région. Par exemple, dans la couche corticale superficielle, les gènes de régulation GABAergique de la transmission synaptique étaient enrichis en H3K27me3, tandis que les gènes de transmission de la synapse glutamatergique avaient une expression élevée et une faible H3K27me3 (Figs supplémentaires 9b, 10b et 11b; GO pour le striatum, les couches corticales superficielles et plus profondes). Contrairement au corps calleux, seul un nombre limité de gènes positifs pour H3K27me3 et l'ARN ont été trouvés dans ces régions. Malgré une anticorrélation générale entre l'expression de l'ARN et le dépôt de H3K27me3, nous avons également observé des différences régionales (colonnes en bleu sur la figure 4d); Nav3 et Sncb, avec de faibles niveaux de H3K27me3 dans le cortex et le striatum, étaient exprimés dans le premier mais pas dans le second (Extended Data Fig. 9h). Le schéma opposé a été observé pour des gènes tels que Ablim2 et Gng7 (Extended Data Fig. 9h). Car2, un gène marqueur exprimé dans les oligodendrocytes et abondant dans le corps calleux, présentait une occupation H3K27me3 dans les couches corticales, contrairement au corps calleux et, de manière surprenante, au striatum (Extended Data Fig. 9c). Ainsi, des mécanismes autres que le dépôt de H3K27me3 médié par Polycomb pourraient être impliqués dans la répression transcriptionnelle de ces gènes dans différentes zones du SNC.

a–c, Corrélation de l'expression des gènes H3K27me3 CSS et ARN (a), de l'expression des gènes H3K27ac GAS et ARN (b) et de l'expression des gènes H3K4me3 GAS et ARN (c) dans le corps calleux. d, tracé bouleversé de l'expression des gènes H3K27me3 CSS et ARN dans le striatum et les couches corticales plus profondes et superficielles ; –, faible expression de CSS ou de gènes ; +, CSS élevé ou expression génique. e, diagrammes de Venn montrant un CSS/GAS élevé (+) ou faible (–) pour différentes modifications d'histones dans le corps calleux avec des gènes marqueurs d'ARN communs.

Données source

Contrairement à H3K27me3, nous avons observé une corrélation robuste entre l'ARN et les marques activatrices H3K4me3 ou H3K27ac dans le corps calleux, avec des gènes fortement exprimés et avec un dépôt élevé dans ces deux modalités régulant les processus dans l'oligodendroglie (Fig. 4b, c et Supplément Fig. 12; GO pour H3K27ac quadrant I et H3K4me3 quadrant I). Par exemple, Mal a montré l'activité ou l'expression la plus élevée dans le corps calleux pour ATAC, H3K27ac, H3K4me3 et l'ARN apparié (Extended Data Fig. 9a). Gpr88, un gène marqueur de MSN, était enrichi dans le striatum pour ATAC, H3K27ac et H3K4me3 mais avec un faible CSS dans le striatum pour H3K27me3 (Extended Data Fig. 9f). De plus, nous avons examiné la régulation collective parmi différentes modifications d'histones dans le corps calleux (Fig. 4e et Fig. 13 et 14 supplémentaires). En général, H3K4me3 et H3K27ac ont montré des corrélations élevées, leurs signaux étant anticorrélés avec H3K27me3 (Fig. 4e). Nous avons également observé la co-occupation de H3K4me3 ou H3K27ac et H3K27me3 dans plusieurs loci de gènes dans cette région tissulaire (Fig. 4e et Fig. 13 et 14 supplémentaires). Ces gènes sont impliqués dans la différenciation et la myélinisation des oligodendrocytes et dans d'autres processus tels que le catabolisme et la localisation des protéines (Figs. 13 et 14 supplémentaires). Certains de ces gènes, tels que Ptprz1 et Fnbp1, présentaient également des niveaux plus élevés de H3K27me3 et d'ARN (Fig. 4a). Comme mentionné ci-dessus, cette bivalence potentielle H3K4me3/H3K27me3 peut refléter un équilibre transcriptionnel.

Nous avons effectué un ATAC-RNA-seq spatial sur la formation de l'hippocampe du cerveau humain adulte (homme de 31 ans), qui est une région cérébrale complexe impliquée dans les fonctions cognitives et les maladies telles que la dépression majeure40 et la maladie d'Alzheimer41. Nous avons identifié sept et huit groupes majeurs pour l'ATAC et l'ARN, respectivement, et le schéma spatial correspondait aux principaux repères anatomiques (Fig. 5a) 3, y compris des gènes marqueurs spécifiques (Fig. 5d). Le cluster ATAC A4 représente la couche de cellules granulaires (GCL) (THY1, BCL11B) et le cluster A6 correspond au plexus choroïde (Fig. 5a, d). Les motifs TF (NEUROD1 et SNAI1) et leurs modèles spatiaux ont été visualisés dans différentes régions tissulaires, et des régulateurs TF positifs ont été identifiés (Extended Data Fig. 10b, c). Pour les données d'ARN, nous avons également détecté des clusters distincts avec des gènes marqueurs uniques (Fig. 5a, d) tels que PROX1 et BCL11B enrichis en cluster R4 (GCL).

a, image en fond clair, distribution spatiale et UMAP de tous les clusters basés sur l'ATAC et l'ARN dans l'hippocampe humain. ML, couche moléculaire ; Pyr, neurones pyramidaux. Taille de pixel, 50 μm, barres d'échelle, 1 mm. b, Intégration de nos données ATAC avec les données scATAC-seq42 de l'hippocampe humain. c, Intégration de nos données ARN avec les données snRNA-seq du cerveau humain43. d, Cartographie spatiale de GAS et expression génique pour des gènes marqueurs sélectionnés dans différents groupes pour ATAC et ARN. Oligo, oligodendrocytes ; astro, astrocytes ; DG, gyrus denté.

Nous avons également effectué l'intégration de nos données ATAC et de nos données scATAC-seq à partir d'échantillons de cerveau humain42 (Fig. 5b), et de nos données d'ARN avec des données de snRNA-seq de cerveau humain adulte43, pour montrer les identités et les états cellulaires dominants. Les types de cellules identifiés par snRNA-seq43 ont été attribués à chaque groupe via un transfert d'étiquette (Fig. 5c et Extended Data Fig. 10a). Des cellules granulaires (GC) ont été détectées dans le GCL, les neurones de la cornu ammonis (CA) étaient enrichis en régions CA3–4 et les VLMC se distinguaient fortement dans le plexus choroïde par opposition aux autres régions.

En général, l'ATAC et l'ARN peuvent facilement résoudre toutes les principales caractéristiques tissulaires de cette région, mais le coséquençage spatial de l'épigénome et du transcriptome peut fournir de nouvelles informations sur le mécanisme de régulation dynamique des gènes qui ne peuvent pas être réalisées par des modalités uniques. Par exemple, PROX1, un gène signature définissant l'identité des neurones granulaires lors de la sélection du destin des neurones pyramidaux44, est en effet fortement exprimé dans GCL mais a montré une accessibilité modeste à la chromatine (Fig. 5d). Cela pourrait être attribué à une demande minimale de synthèse de nouveaux transcrits PROX1 dans les cellules granulaires matures postmitotiques, et n'est donc pas nécessaire pour maintenir un état de chromatine ouvert actif.

Les technologies d'omiques spatiales (épigénomique spatiale, transcriptomique et protéomique), basées sur NGS1,2,3,4,45,46,47 ou sur l'imagerie5,48, offrent une opportunité sans précédent de générer de nouvelles et riches informations sur la régulation des gènes dans le contexte tissulaire spatial. Cependant, pour bien comprendre le mécanisme de régulation des gènes, différentes couches d'informations omiques doivent être profilées simultanément. Cela a été démontré pour la première fois dans des cellules individuelles dissociées6,7,8,9 mais n'a pas encore été réalisé directement dans les tissus. L'hybridation in situ par fluorescence séquentielle d'ADN basée sur l'imagerie combinée à l'hybridation in situ par fluorescence séquentielle d'ARN a détecté la chromatine spatiale et l'expression génique pour les gènes cibles et les locus génomiques sélectionnés49. À ce jour, les technologies actuelles n'ont pas été en mesure d'effectuer une comparaison impartiale à l'échelle du génome de l'épigénome et du transcriptome sur la même section de tissu au niveau cellulaire. Nous avons développé ATAC-ARN-seq spatial et CUT&Tag-ARN-seq spatial (appliqué à H3K27me3, H3K27ac et H3K4me3) pour le co-profilage de l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome ou des modifications d'histones en conjonction avec le transcriptome entier sur la même section de tissu à une résolution quasi unicellulaire (disponible pour la navigation spatiale, voir « Disponibilité des données »). Ces techniques ont été appliquées au comapping du cerveau embryonnaire et juvénile de souris, ainsi que du cerveau humain adulte. Le coséquençage épigénome-transcriptome spatial a produit deux couches d'informations omiques spatiales directement dans les tissus, avec une qualité de données similaire à celle précédemment obtenue par des modalités uniques. Ces technologies nous permettent d'examiner la dynamique spatio-temporelle et les mécanismes de régulation des gènes à l'échelle du génome dans le contexte tissulaire.

Nous avons démontré soit ATAC ou CUT & Tag en conjonction avec l'ARN pour la cartographie multiomique spatiale. Il pourrait être possible de combiner les trois - accessibilité de la chromatine, modifications des histones et transcriptome - pour délimiter un paysage plus complet du réseau de régulation des gènes dans les tissus. Il pourrait également être possible de mesurer simultanément plusieurs modifications d'histones pour évaluer l'effet de multivalence sur la régulation de l'expression spatiale des gènes. Auparavant, nous avons démontré le profilage spatial du transcriptome et d'un large panel de protéines1. Nous envisageons qu'il est possible et très utile de combiner davantage l'épigénome, le transcriptome et le protéome50 pour disséquer les schémas spatiaux du type cellulaire, de l'état et de la régulation des gènes. Enfin, la multiomique spatiale telle que rapportée ici peut trouver des applications étendues au-delà des neurosciences et de la biologie du développement. Par exemple, plusieurs modalités de cartographie spatiale des tissus pathologiques humains non seulement se valident les unes les autres, mais permettent également de mieux élucider les mécanismes à l'origine des états cellulaires anormaux qui ne pouvaient pas être facilement discernés à l'aide de méthodes à une seule modalité. En outre, les informations spatiales peuvent en outre montrer comment l'environnement tissulaire local affecte l'état, la dynamique et la fonction des cellules dans toutes les couches du dogme central. Dans ce travail, nous avons développé un appareil avec une zone de cartographie plus grande et un débit plus élevé qui permet la cartographie d'une zone de tissu quatre fois plus grande, en utilisant des codes à barres 100 × 100 (total de 10 000 pixels, taille de pixel de 20 μm) pour couvrir presque tout l'hémisphère d'une section coronale du cerveau d'une souris P22 juvénile. La conception du canal en serpentin permet le traitement simultané de cinq échantillons de tissus, chacun cartographié pour 10 000 pixels. Il est possible d'augmenter encore la zone de cartographie en augmentant le nombre de codes-barres et d'améliorer encore le débit en utilisant la manipulation automatisée des liquides.

En résumé, le coséquençage de l'épigénome et du transcriptome à l'échelle du génome à résolution spatiale représente l'un des outils les plus informatifs de la biologie spatiale et peut être appliqué à un large éventail de recherches biologiques et biomédicales.

Des coupes congelées sagittales d'embryons de souris C57 (n° MF-104-13-C57) ont été achetées auprès de Zyagen. Des embryons de souris E13 fraîchement récoltés ont été congelés instantanément dans des composés à température de coupe optimale et sectionnés à une épaisseur de 7 à 10 μm. Des coupes de tissus ont été recueillies sur des lames de verre revêtues de poly-l-lysine (Electron Microscopy Sciences, n° 63478-AS).

Du tissu cérébral de souris juvénile (P21-P22) a été obtenu à partir de la lignée de protéine fluorescente verte améliorée Sox10:Cre-RCE:LoxP (eGFP) sur un fond génétique mixte C57BL/6xCD1 conservé au Karolinska Institutet. La lignée a d'abord été générée en croisant des animaux Sox10:Cre (The Jackson Laboratory, n° 025807) avec des animaux RCE:loxP (eGFP) (The Jackson Laboratory, n° 032037-JAX). Cela a été établi et maintenu en reproduisant des mâles dépourvus de l'allèle Cre avec des femelles portant un allèle Cre hémizygote; l'allèle rapporteur a été maintenu en homozygotie ou en hémizygotie chez les mâles et les femelles. Cela a abouti à un marquage spécifique de la lignée des oligodendrocytes avec eGFP. Tous les animaux étaient exempts d'agents pathogènes bactériens et viraux de souris, d'ectoparasites et d'endoparasites. Le cycle lumière/obscurité suivant a été maintenu pour les souris : aube, 06h00-07h00 ; lumière du jour, 07h00–18h00 ; crépuscule, 18h00-19h00 ; nuit, 19:00–06:00. Les souris ont été logées dans des cages ventilées individuellement à un nombre maximum de cinq par cage (IVC sealsafe GM500, tecniplast). Les paramètres généraux du logement, y compris la température, la ventilation et l'humidité relative, ont suivi la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et à d'autres fins scientifiques. La qualité de l'air a été contrôlée à l'aide d'unités de traitement d'air autonomes équipées d'un filtre à particules à haute efficacité. L'humidité relative de l'air était constamment de 55 ± 10 %, à une température de 22 °C. Les paramètres d'élevage ont été surveillés avec des unités ScanClime (Scanbur). Les cages contenaient un abri en carton, des bâtons à ronger et du matériel de nidification (Scanbur), posés sur une litière en bois dur (TAPVEI). Les souris ont reçu un régime alimentaire régulier et de l'eau a été fournie par une bouteille d'eau et changée chaque semaine. Les cages ont été changées toutes les 2 semaines dans une hotte à flux d'air laminaire.

Les souris ont été sacrifiées à P21/P22 (les deux sexes ont été utilisés) par anesthésie avec de la kétamine (120 mg kg–1 de poids corporel) et de la xylazine (14 mg kg–1 de poids corporel), suivie d'une perfusion transcrânienne avec du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné froid (87 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 75 mM saccharose, 2 glucose 0 mM, CaCl2*2H2O 1 mM et MgSO4*7H2O 2 mM dans H2O distillée). Après isolement, les cerveaux ont été maintenus pendant une période de temps minimale dans du liquide céphalo-rachidien artificiel jusqu'à l'incorporation dans le composé Tissue-Tek OCT (Sakura) et la congélation rapide à l'aide d'un mélange de neige carbonique et d'éthanol. Des cryosections coronales de 10 μm ont été montées sur des lames de verre revêtues de poly-l-lysine (n° 63478-AS, Electron Microscopy Sciences) ou des lames de verre de 2 × 3 pouces carrés (AtlasXomics).

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément à la directive européenne no. 2010/63/UE, directive suédoise locale no. L150/SJVFS/2019:9, Saknr no. Lignes directrices complémentaires L150 et Karolinska Institutet pour l'achat et l'utilisation d'animaux de laboratoire, no. Dnr. 1937/03-640. Toutes les procédures décrites ont été approuvées par le comité local pour les expériences éthiques sur les animaux de laboratoire en Suède (Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd, nos. 1995/2019 et 7029/2020).

Des tissus cérébraux humains ont été obtenus à partir de la collection de cerveaux de l'Institut psychiatrique de l'État de New York à l'Université de Columbia, qui comprend des échantillons de cerveaux de la République de Macédoine. La collecte de tissus cérébraux a été réalisée avec l'approbation du comité d'examen institutionnel de l'Institut psychiatrique de l'État de New York et le consentement éclairé obtenu du plus proche parent qui a accepté de faire don des cerveaux et de participer à des entretiens d'autopsie psychologique.

Nous avons analysé le tissu cérébral de l'hippocampe d'un homme de race blanche de 31 ans, sans diagnostic psychiatrique ou neurologique, décédé des suites d'un accident traumatique et présentant un niveau élevé de fonctionnement global avant le décès, tel que mesuré par le score de l'échelle d'évaluation globale51, qui était de 90 (score de 1 à 100, avec 100 la fonction la plus élevée) et avec une toxicologie négative pour les médicaments psychotropes et les drogues. L'intervalle post-mortem (temps entre la mort et la collecte du cerveau) était de 6,5 h.

La région antérieure de l'hippocampe a été disséquée à partir d'une section coronale fraîchement congelée (épaisseur de 20 mm) de l'hémisphère droit du cerveau. La région du gyrus denté (environ 10 × 10 mm2) de la région antérieure de l'hippocampe a été sélectionnée. Des cryosections de 10 μm ont été prélevées sur des lames de verre revêtues de poly-l-lysine (n° 63478-AS, Electron Microscopy Sciences). Les échantillons ont été stockés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation ultérieure.

La transposase Tn5 déchargée (n° C01070010) et pA-Tn5 (n° C01070002) ont été achetées chez Diagenode, et le transposome a été assemblé selon les directives du fabricant. Les oligos appliqués pour l'assemblage du transposome étaient :

Tn5ME-A, 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′,

Tn5MErev, 5′-/5Phos/CTGTCTCTTATACACATCT-3′ et

Tn5ME-B, 5′-/5Phos/CATCGGCGTACGACTAGATGTGTATAAGAGACAG-3′

Les oligos d'ADN utilisés pour la PCR et la construction de bibliothèques sont présentés dans le tableau supplémentaire 4. Toutes les séquences de codes-barres d'ADN sont fournies dans les tableaux supplémentaires 5 et 6 et tous les autres produits chimiques et réactifs dans le tableau supplémentaire 7.

Des photomasques chromés ont été achetés auprès de Front Range Photomasks, avec une largeur de canal de 20 ou 50 μm. Les moules pour dispositifs microfluidiques en polydiméthylsiloxane (PDMS) ont été fabriqués en utilisant la photolithographie standard. Les directives du fabricant ont été suivies pour déposer par centrifugation le photorésist SU-8 négatif (n° SU-2025 et SU-2010, Microchem) sur une plaquette de silicium (n° C04004, WaferPro). Les hauteurs des caractéristiques étaient d'environ 20 et 50 μm pour les appareils de 20 et 50 μm de large, respectivement. Des dispositifs microfluidiques PDMS ont été fabriqués à l'aide des moules SU-8. Nous avons mélangé les agents de durcissement et de base dans un rapport de 1:10 et avons versé le mélange dans les moules. Après dégazage pendant 30 minutes, le mélange a été durci à 70°C pendant 2 heures. Le PDMS solidifié a été extrait pour une utilisation ultérieure. Nous avons publié un protocole détaillé pour la fabrication et la préparation du dispositif PDMS52.

Les lames de tissu congelées ont été décongelées pendant 10 min à température ambiante. Le tissu a été fixé avec du formaldéhyde (0, 2%, avec 0, 05 U μl – 1 inhibiteur de RNase) pendant 5 min et trempé avec de la glycine 1, 25 M pendant 5 min supplémentaires. Après fixation, le tissu a été lavé deux fois avec 1 ml de 0,5 x DPBS-RI et nettoyé avec de l'eau déionisée (DI) H2O.

La perméabilisation des tissus a été réalisée avec 200 μl de tampon de lyse (3 mM MgCl2, 0,01 % Tween-20, 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01 % NP40, 10 mM NaCl, 1 % albumine de sérum bovin (BSA), 0,001 % digitonine, 0,05 U μl–1 inhibiteur de RNase) pendant 1 5 min et lavé deux fois avec 200 µl de tampon de lavage (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 % BSA, 0,1 % Tween-20) pendant 5 min. Un mélange de transposition (5 μl de transposome fait maison, 33 μl de 1× DPBS, 50 μl de tampon de tagmentation 2×, 1 μl de digitonine à 1 %, 1 μl de 10 % de Tween-20, 0,05 μl–1 inhibiteur de RNase, 10 μl de H2O sans nucléase) a été ajouté avec incubation à 37 °C pendant 30 min. Ensuite, 200 μl d'EDTA 40 mM avec 0, 05 μl – 1 inhibiteur de RNase ont été ajoutés avec incubation pendant 5 min à température ambiante, pour arrêter la transposition. Enfin, les coupes de tissus ont été lavées deux fois avec 200 μl de 0, 5 × PBS-RI pendant 5 min et nettoyées avec de l'eau DI.

Pour la RT, le mélange suivant a été utilisé : 12,5 μl de tampon RT 5×, 4,5 μl d'eau sans RNase, 0,4 μl d'inhibiteur de RNase, 0,8 μl d'inhibiteur de Superase In RNase, 3,1 μl de désoxynucléotide triphosphate 10 mM chacun, 6,2 μl de Maxima H Minus Reverse Transcriptase, 25 μl de 0,5 × PBS-RI et 10 µl d'amorce RT. Les tissus ont été incubés pendant 30 min à température ambiante, puis à 42°C pendant 90 min dans une boîte humide. Après la réaction de RT, les tissus ont été lavés avec 1 × NEBuffer 3.1 et 1 % d'inhibiteur de RNase pendant 5 min.

Pour la ligature in situ du premier code à barres (code à barres A), la première puce PDMS a été recouverte de la région tissulaire d'intérêt. À des fins d'alignement, un objectif 10 × (Thermo Fisher Scientific, microscope EVOS FL Auto n° AMF7000, révision du logiciel EVOS FL Auto 2 2.0.2094.0) a été utilisé pour prendre une image en fond clair. Le dispositif PDMS et la lame de tissu ont été serrés fermement avec une pince acrylique faite maison. Le code-barres A a d'abord été recuit avec le lieur de ligature 1, 10 μl de lieur de ligature 100 μM, 10 μl de 100 μM chaque code-barres A et 20 μl de tampon de recuit 2 × (Tris 20 mM pH 7, 5 à 8, 0, NaCl 100 mM, EDTA 2 mM) et bien mélangé. Pour chaque canal, 5 μl de mélange maître de ligature ont été préparés avec 2 μl de mélange de ligation (27 μl de tampon T4 ADN ligase, 72,4 μl d'eau sans RNase, 5,4 μl de 5% Triton X-100, 11 μl de T4 ADN ligase), 2 μl de 1× NEBuffer 3.1 et 1 μl de chaque code-barres d'ADN recuit A (A1-A50/A100, 25 μM). Le vide a été utilisé pour charger le mélange maître de ligature dans 50 canaux du dispositif, suivi d'une incubation à 37 ° C pendant 30 min dans une boîte humide. La puce PDMS et la pince ont été retirées après lavage avec 1 × NEBuffer 3.1 pendant 5 min. La lame a été lavée à l'eau et séchée à l'air.

Pour la ligature in situ du deuxième code à barres (code à barres B), la deuxième puce PDMS a été recouverte sur la lame et une autre image en fond clair a été prise avec l'objectif 10 ×. Une pince acrylique a été appliquée pour serrer le PDMS et la lame de tissu ensemble. Le recuit des codes-barres B (B1-B50/B100, 25 μM) et la préparation du mélange maître de ligature ont été effectués comme pour les codes-barres A. Le dispositif a été incubé à 37 °C pendant 30 min dans une boîte humide. La puce PDMS et la pince ont été retirées après lavage avec 1 × DPBS avec un inhibiteur de SUPERase In RNase pendant 5 min. La lame a été lavée à l'eau et séchée à l'air. Une image en fond clair a ensuite été prise pour un alignement supplémentaire.

Pour la lyse tissulaire, la région d'intérêt a été digérée avec 100 μl de mélange de réticulation inverse (0, 4 mg ml – 1 protéinase K, EDTA 1 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8, 0, NaCl 200 mM, 1% SDS) à 58 ° C pendant 2 h dans une boîte humide. Le lysat a été recueilli dans un tube de 1,5 m et incubé à 65°C pendant une nuit.

Pour la séparation de l'ADN et de l'ADNc, le lysat a été purifié avec Zymo DNA Clean & Concentrator-5 et élué à 100 μl d'eau sans RNase. Le tampon 1× B&W avec 0,05 % de Tween-20 a été utilisé pour laver trois fois 40 µl de billes Dynabeads MyOne Streptavidin C1. Ensuite, 100 μl de tampon 2 × B&W avec 2, 5 μl d'inhibiteur de SUPERase In RNase ont été utilisés pour remettre en suspension les billes, qui ont ensuite été mélangées avec le lysat et laissées se lier à température ambiante pendant 1 h sous agitation. Un aimant a été utilisé pour séparer les billes et le surnageant dans le lysat.

Le surnageant a été retiré pour la construction de la bibliothèque ATAC, puis purifié avec Zymo DNA Clean & Concentrator-5 et élué dans 20 μl d'eau sans RNase. Une solution PCR (25 μl de 2 × NEBNext Master Mix, 2,5 μl d'amorce i7 indexée 25 μM, 2,5 μl d'amorce PCR 25 μM P5) a été ajoutée et bien mélangée. La PCR a d'abord été réalisée avec le programme suivant : 72 °C pendant 5 min, 98 °C pendant 30 s et cycle à 98 °C pendant 10 s, 63 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 1 min, cinq fois. Pour déterminer les cycles supplémentaires, le mélange préamplifié (5 μl) a été mélangé avec une solution de PCR quantitative (qPCR) (5 μl de 2 × NEBNext Master Mix, 0,24 μl de 25 × SYBR Green, 0,5 μl de 25 μM new P5 PCR primer, 3,76 μl de H2O sans nucléase, 0,5 μl de 25 μM amorce i7 indexée). La réaction qPCR a ensuite été réalisée avec le programme suivant : 98 °C pendant 30 s avec des cycles à 98 °C pendant 10 s, 63 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 1 min, 20 fois. L'ADN préamplifié restant (45 μl) a été amplifié en exécutant des cycles supplémentaires comme déterminé par qPCR (pour atteindre un tiers du signal saturé). Le produit PCR final a été purifié par des billes 1X Ampure XP (45 μl) et élué dans 20 μl de H2O sans nucléase.

Les billes ont été utilisées pour la construction de la bibliothèque d'ADNc. Ils ont d'abord été lavés deux fois avec 400 µl de tampon B&W 1X avec 0,05% de Tween-20 et une fois avec du Tris 10 mM pH 8,0 contenant 0,1% de Tween-20. Des billes de streptavidine avec des molécules d'ADNc liées ont été remises en suspension dans une solution TSO (22 μl de désoxynucléotide triphosphate 10 mM chacun, 44 μl de tampon Maxima RT 5×, 44 μl de solution Ficoll PM-400 à 20 %, 88 μl d'eau sans RNase, 5,5 μl d'amorce de commutation de matrice 100 μM (AAGCAGTGGT ATCAACGCAGAGTGAATrGrG+G), 11 μl de Maxima H Minus Reverse Transcriptase, 5,5 μl d'inhibiteur de RNase). Les billes ont été incubées à température ambiante pendant 30 min puis à 42°C pendant 90 min, sous agitation douce. Après avoir lavé les billes une fois avec 400 μl de Tris 10 mM et 0,1% de Tween-20 et une fois avec de l'eau, elles ont été remises en suspension dans une solution PCR (110 μl de 2 × Kapa HiFi HotStart Master Mix, 8,8 μl d'amorces 10 μM 1 et 2, 92,4 μl d'eau sans RNase). Le thermocyclage PCR a été réalisé en utilisant le programme suivant : 95 °C pendant 3 min et cyclage à 98 °C pendant 20 s, 65 °C pendant 45 s et 72 °C pendant 3 min, cinq fois. Après cinq cycles, les billes ont été retirées de la solution PCR et du SYBR Green 25x a été ajouté à une concentration de 1x. Les échantillons ont de nouveau été placés dans une machine qPCR avec les conditions de thermocyclage suivantes : 95 °C pendant 3 min, cycle à 98 °C pendant 20 s, 65 °C pendant 20 s et 72 °C pendant 3 min, 15 fois, suivi de 5 min à 72 °C. La réaction a été supprimée une fois que le signal qPCR a commencé à atteindre un plateau. Le produit de PCR a été purifié avec des billes Ampure XP 0,8 x et élué dans 20 μl de H2O sans nucléase.

Un kit de préparation de bibliothèque Nextera XT a été utilisé pour la préparation de la bibliothèque. L'ADNc purifié (1 ng) a été dilué dans de l'eau sans RNase jusqu'à un volume total de 5 μl, puis 10 μl de tampon ADN Tagment et 5 μl de mélange Amplicon Tagment ont été ajoutés avec incubation à 55 ° C pendant 5 min; 5 µl de tampon NT ont ensuite été ajoutés, avec incubation à température ambiante pendant 5 min. Une solution maître PCR (15 μl de PCR master mix, 1 μl d'amorce P5 10 μM, 1 μl d'amorce P7 indexée 10 μM, 8 μl d'eau sans RNase) a été ajoutée et la réaction PCR réalisée avec le programme suivant : 95 °C pendant 30 s, cycle à 95 °C pendant 10 s, 55 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 5 min, pendant 12 cycles. Le produit de PCR a été purifié avec des billes Ampure XP 0,7 x pour obtenir la bibliothèque.

Une puce Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip a été utilisée pour déterminer la distribution de taille et la concentration de la bibliothèque avant le séquençage. La NGS a été réalisée sur un séquenceur Illumina NovaSeq 6000 (mode apparié, 150 paires de bases).

La lame de tissu congelée a été décongelée pendant 10 minutes à température ambiante. Le tissu a été fixé avec du formaldéhyde (0, 2%, avec 0, 05 U μl – 1 inhibiteur de RNase) pendant 5 min et trempé avec de la glycine 1, 25 M pendant 5 min supplémentaires. Après fixation, le tissu a été lavé deux fois avec 1 ml de tampon de lavage (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM pH 7,5, un comprimé de cocktail d'inhibiteurs de protéase, spermidine 0,5 mM) et plongé dans de l'eau DI. La coupe de tissu a été perméabilisée avec un tampon de lavage NP40-digitonine (0,01 % de digitonine, 0,01 % de NP40 dans un tampon de lavage) pendant 5 min. L'anticorps primaire (dilution 1:50 avec un tampon d'anticorps (0,001% BSA, EDTA 2 mM dans un tampon de lavage NP40-digitonine) a été ajouté avec incubation à 4 ° C pendant la nuit. une dilution du complexe adaptateur pA-Tn5 dans un tampon de 300 lavages (un comprimé de cocktail d'inhibiteurs de protéase, 300 mM de NaCl, 0,5 mM de spermidine, 20 mM d'HEPES, pH 7,5) a été ajoutée avec incubation à température ambiante pendant 1 h, suivie d'un lavage de 5 min avec un tampon de 300 lavages. Un tampon de tagmentation (10 mM MgCl2 dans un tampon de 300 lavages) a été ajouté avec incubation à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, 40 mM d'EDTA avec 0, 05 U μl - 1 inhibiteur de RNase ont été ajoutés avec incubation à température ambiante pendant 5 min pour arrêter la tagmentation. Le tissu a été lavé deux fois avec 0, 5 × DPBS-RI pendant 5 min pour une utilisation ultérieure.

Pour la RT, deux ligatures et la séparation des billes, les protocoles étaient les mêmes que pour l'ATAC spatial – ARN-seq. Pour la construction de la bibliothèque CUT&Tag, le surnageant a été purifié avec Zymo DNA Clean & Concentrator-5 et élué dans 20 μl d'eau sans RNase. Une solution PCR (2 μl de 10 μM d'amorce PCR P5 et d'amorce i7 indexée, 25 μl de NEBNext Master Mix) a été ajoutée et bien mélangée. La PCR a été réalisée avec le programme suivant : 58 °C pendant 5 min, incubation à 72 °C pendant 5 min et 98 °C pendant 30 s puis cyclage à 98 °C pendant 10 s, avec incubation à 60 °C pendant 10 s 12 fois et une incubation finale à 72 °C pendant 1 min. Le produit de PCR a été purifié par des billes 1,3 × Ampure XP en utilisant le protocole standard et élué dans 20 μl de H2O sans nucléase. La construction de la bibliothèque d'ADNc a suivi le protocole spatial ATAC – RNA-seq.

Pour les données ATAC et CUT&Tag, les lieurs 1 et 2 ont été utilisés pour filtrer la lecture 2 et les séquences ont été converties au format Cell Ranger ATAC v.1.2 (10X Genomics). Les séquences du génome se trouvaient dans la lecture 1 nouvellement formée, et les codes à barres A et B ont été inclus dans la lecture 2 nouvellement formée. La référence humaine (GRCh38) ou la référence de la souris (GRCm38) a été utilisée pour aligner les fichiers fastq. Les fragments de type BED ainsi obtenus ont été utilisés pour effectuer une analyse en aval. Le fichier de fragments comprend des fragments d'informations sur les emplacements spatiaux (code-barres A × code-barres B) et le génome.

Pour les données d'ARN, la lecture 2 a été affinée pour extraire le code-barres A, le code-barres B et l'UMI. Le pipeline ST v.1.7.2 (réf. 53) a été utilisé pour cartographier la lecture 1 traitée par rapport au génome de la souris (GRCm38) ou au génome humain (GRCh38), qui a créé la matrice génétique pour l'analyse en aval contenant des informations sur les gènes et les emplacements spatiaux (code-barres A × code-barres B).

Nous avons d'abord identifié l'emplacement des pixels sur les tissus à partir de l'image en fond clair à l'aide de MATLAB 2020b (https://github.com/edicliuyang/Hiplex_proteome).

Signac v.1.8 (réf. 54) a été chargé dans R v.4.1. Les matrices ATAC, CUT&Tag et ARN ont été lues dans Signac v.1.8 (réf. 54). La fonction « DefaultAssay » a été utilisée pour le dosage de l'ARN. Pour la visualisation des données d'ARN, la fonctionnalité a été définie sur 3 000 avec la fonction "FindVariableFeatures", puis les données ont été normalisées à l'aide de la fonction "SCTransform". Les données d'ARN normalisées ont été regroupées et l'ARN UMAP a été construit. La fonction DefaultAssay a été appliquée au test ATAC/CUT&Tag. Pour la visualisation des données ATAC/CUT&Tag, la coupure minimale a été définie avec la fonction « FindTopFeatures ». Les données ont été normalisées et réduites dimensionnellement à l'aide d'une indexation sémantique latente, puis les données ATAC/CUT&Tag ont été regroupées et ATAC/CUT&Tag UMAP a été construit.

La fonction DefaultAssay a été utilisée pour le dosage conjoint ATAC/CUT&Tag et ARN. Pour la visualisation des données conjointes ATAC/CUT&Tag et ARN55, la fonction « FindMultiModalNeighbors » a été utilisée. La liste de réduction a été définie sur ('pca', 'lsi'), la liste des dimensions a été définie sur celle de l'ARN et de l'ATAC/CUT&Tag, la modalité weight.name a été définie sur le poids de l'ARN et l'UMAP conjointe a été construite.

Pour tracer ensemble les UMAP générés ci-dessus, DefaultAssay a été défini sur ARN et les UMAP pour ATAC/CUT&Tag, ARN ou ATAC/CUT&Tag et ARN conjoints ont été visualisés séparément à l'aide de 'DimPlot'.

En ce qui concerne la visualisation des données spatiales de l'ARN, la matrice génétique obtenue à partir de l'ARN a été chargée dans Seurat v.4.1 (réf. 56) en tant qu'objet Seurat, et les métadonnées d'ARN obtenues à partir de Signac ont été lues dans l'objet Seurat. Toutes les cartes spatiales ont ensuite été tracées avec la fonction 'SpatialPlot'.

En ce qui concerne la visualisation des données spatiales ATAC/CUT&Tag, le fichier fragment obtenu à partir de ATAC/CUT&Tag a été lu dans ArchR v.1.0.1 (réf. 13) en tant qu'ArchRProject et les métadonnées ATAC/CUT&Tag obtenues à partir de Signac ont été lues dans ArchRProject. Les données d'ArchRProject ont été normalisées et dimensionnellement réduites à l'aide d'une indexation sémantique latente itérative. Pour le calcul GAS et CSS, nous avons utilisé le modèle Gene Score dans ArchR. Une matrice de score génétique a été obtenue pour une analyse en aval. Les fonctions 'getMarkerFeatures' et 'getMarkers' dans ArchR (testMethod = "Wilcoxon", cutOff = "FDR <= 0.05", groupBy = "seurat_cluster") ont été utilisées pour trouver les gènes/régions marqueurs pour chaque cluster. Pour visualiser les données spatiales, les résultats obtenus à partir d'ArchR ont été entrés dans Seurat v.4.1 pour cartographier les données sur le tissu. La taille des pixels a été mise à l'échelle à l'aide du paramètre 'pt.size.factor' dans le package Seurat pour une meilleure visualisation.

Pour les liens pic à gène, nous avons saisi l'objet ARN Seurat à l'aide de la fonction 'addGeneIntegrationMatrix' dans ArchR, puis les liens pic à gène ont été dessinés avec la fonction 'addPeak2GeneLinks'. La co-accessibilité des pics a été calculée à l'aide de la fonction « addCoAccessibility » dans ArchR.

Seurat v.4.1 (réf. 56) a été utilisé pour l'intégration des données d'ARN et l'identification du type de cellule, et la fonction 'SCTransform' pour normaliser nos données spatiales d'ARN et de scRNA-seq. La fonction 'SelectIntegrationFeatures' a été utilisée pour obtenir des caractéristiques communes aux deux jeux de données. La fonction 'FindIntegrationAnchors' a été appliquée pour trouver des ancres, et la fonction 'IntegrateData' pour créer un ensemble de données intégré à travers les ancres identifiées. L'ensemble de données intégré obtenu a été regroupé, montrant une bonne correspondance entre nos données spatiales d'ARN et de scRNA-seq. La fonction 'FindTransferAnchors' a été utilisée pour trouver des ancres de transfert, qui ont ensuite été utilisées pour effectuer le transfert d'étiquettes avec la fonction 'TransferData' (si plus d'un type de cellule était présenté dans un pixel, le type de cellule principal était attribué).

Signac v.1.8 et Seurat v.4.1 ont été utilisés pour l'intégration de nos données ATAC/CUT&Tag et scATAC-seq/scCUT&Tag. Les données scATAC-seq/scCUT&Tag ont été quantifiées en fonction de nos données ATAC/CUT&Tag pour s'assurer qu'il y avait des caractéristiques communes aux deux ensembles de données. La fonction FindIntegrationAnchors (reduction = "rlsi") a été utilisée pour identifier les ancres entre les deux jeux de données. La fonction 'IntegrateEmbeddings' a été utilisée pour obtenir un jeu de données intégré à travers les ancres identifiées. L'ensemble de données intégré obtenu a été regroupé, montrant une bonne correspondance entre nos données spatiales ATAC/CUT&Tag et scATAC-seq/scCUT&Tag. Pour les données ATAC, la fonction FindTransferAnchors a été utilisée pour trouver des ancres de transfert, qui ont ensuite été utilisées pour mapper scATAC-seq à nos données spatiales ATAC avec la fonction 'MapQuery'.

ArchR v.1.0.1 a été utilisé pour l'identification du type de cellule pour nos données ATAC/CUT&Tag à partir de données scRNA-seq. La matrice de score génétique de notre ATAC/CUT&Tag a été comparée à la matrice d'expression génique de scRNA-seq, et les pixels alignés de nos données ATAC/CUT&Tag avec des cellules de scRNA-seq. La fonction « GeneIntegrationMatrix » a été utilisée pour ajouter des profils pseudo-scRNA-seq et des identités cellulaires.

Une analyse de corrélation a été effectuée pour différentes régions tissulaires. L'hémisphère cérébral de la souris a été séparé en sept clusters (corpus calleux, striatum, couche corticale superficielle, couche corticale plus profonde, ventricule latéral, noyau septal latéral et autres) selon les clusters d'ARN et l'annotation anatomique, et nommé « tissue_clusters ». Pour la Fig. 4a – c, la fonction 'FindMarkers' (paramètres : min.pct = 0,25, logfc.threshold = 0,25) a été utilisée pour calculer nos données d'ARN et les gènes avec P ajusté <10−5 sélectionnés comme gènes marqueurs. La fonction getMarkerFeatures (paramètres : groupBy = "tissue_clusters") a été appliquée pour calculer le GAS ou le CSS des gènes de la liste des gènes marqueurs (cutOff = "FDR <= 0,05" & (cutOff = "Log2FC >= 0,1" ou cutOff = "Log2FC <= −0,1")). Si avg_log2FC > 0 (ARN) et Log2FC > 0 (CUT&Tag) pour un gène spécifique, cela apparaît dans le quadrant I. L'analyse d'enrichissement GO a été effectuée avec la fonction « enrichGO » (qvalueCutoff = 0,05) dans le package clusterProfiler v.4.225.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données brutes et traitées rapportées dans cet article sont déposées dans Gene Expression Omnibus avec le code d'accession GSE205055. Ces ensembles de données sont disponibles sous forme de ressources Web et peuvent être parcourus dans les coordonnées spatiales des tissus dans le navigateur de cellules et de génomes de l'UCSC (https://brain-spatial-omics.cells.ucsc.edu) et dans notre propre portail de données généré avec AtlasXplore (https://web.atlasxomics.com/visualization/Fan). Les données sont également disponibles sur https://ki.se/en/mbb/oligointernode. Les fichiers fastq résultants ont été alignés sur le génome de référence humain (GRCh38) (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/chromosomes/) ou sur le génome de référence de la souris (GRCm38) (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/chromosomes/). Les données publiées pour l'intégration et la comparaison de la qualité sont disponibles en ligne : ENCODE ATAC-seq (embryon de souris E13.5) (https://www.encodeproject.org/search/?type=Experiment&status=released&related_series.@type=OrganismDevelopmentSeries&replicates.library.biosample.organism.scientific_name=Mus+musculus&assay_title=ATAC-seq&life_stage_age=embryonic%2013 .5 % 20 jours ); ENCODE RNA-seq (embryon de souris E13.5) : cerveau antérieur (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78493) ; mésencéphale (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78456); cerveau postérieur (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78481); atlas cellulaire de l'organogenèse de la souris (https://oncoscape.v3.sttrcancer.org/atlas.gs.washington.edu.mouse.rna/downloads); atlas des éléments régulateurs des gènes dans le cerveau de la souris adulte (http://catlas.org/mousebrain/#!/downloads) ; atlas du cerveau de la souris adolescente (http://mousebrain.org/adolescent/downloads.html); données scCUT&Tag H3K27ac sur le cerveau de souris (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM5949207); données scCUT&Tag H3K27me3 sur le cerveau de souris (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM5949205); données scCUT&Tag H3K4me3 sur le cerveau de souris (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE163532); hippocampe humain (snRNA-seq) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE186538 ; et hippocampe humain (scATAC-seq) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/a cc.cgi?acc=GSE147672). Les données sources sont fournies avec cet article.

Le code pour l'analyse des données de séquençage est disponible sur Github (https://github.com/di-0579/Spatial_epigenome-transcriptome_co-sequencing) et archivé sur Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7395313).

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Nous remercions le Yale Center for Research Computing pour les conseils et l'utilisation de l'infrastructure informatique de recherche. Les moules pour dispositifs microfluidiques ont été fabriqués au centre de nanofabrication de la Yale University School of Engineering and Applied Science. La NGS a été menée au Yale Center for Genome Analysis et au Yale Stem Cell Center Genomics Core Facility, soutenu par le Connecticut Regenerative Medicine Research Fund et la Li Ka Shing Foundation. Le service fourni par le Genomics Core of Yale Cooperative Center of Excellence in Hematology (no. U54DK106857) a été utilisé. Nous remercions T. Jimenez-Beristain pour la rédaction des permis d'éthique des animaux de laboratoire et l'assistance aux expérimentations animales, ainsi que le personnel de Comparative Medicine-Biomedicum. M. Bartosovic a été financé par la subvention Vinnova Seal of Excellence Marie-Sklodowska Curie Actions RNA-centric view on oligodendrocyte lineage development (RODent). EA a été financé par l'Union européenne, Horizon 2020, les actions Marie-Sklodowska Curie et la subvention SOLO (n° 794689). Les travaux du groupe de recherche de GC-B. ont été soutenus par le Conseil suédois de la recherche (subvention n° 2019-01360), la Société suédoise du cancer (Cancerfonden, n° 190394 Pj), la Fondation Knut et Alice Wallenberg (subvention n° 2019-0107 et 2019-0089), la Société suédoise pour la recherche médicale (subvention n° JUB2019), la Fondation Göran Gustafsson pour la recherche en Sciences naturelles et médecine, le Centre Ming Wai Lau de médecine réparatrice et l'Institut Karolinska. Cette recherche a été soutenue par Packard Fellowship for Science and Engineering (à RF), Yale Stem Cell Center Chen Innovation Award (à RF) et les National Institutes of Health des États-Unis (nos RF1MH128876, U54AG076043, U54AG079759, UG3CA257393, UH3CA257393, R01CA245313 et U54CA274509 à RF). YL a été soutenu par la Society for ImmunoTherapy of Cancer Fellowship.

Financement en libre accès fourni par l'Institut Karolinska.

Yanxiang Deng

Adresse actuelle : Department of Pathology and Laboratory Medicine, Epigenetics Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphie, PA, États-Unis

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Di Zhang, Yanxiang Deng

Département de génie biomédical, Université de Yale, New Haven, CT, États-Unis

Di Zhang, Yanxiang Deng, Graham Su, Shuozhen Bao, Yang Liu et Rong Fan

Yale Stem Cell Center et Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, New Haven, CT, États-Unis

Yanxiang Deng, Graham Su, Yang Liu et Rong Fan

Laboratoire de neurobiologie moléculaire, Département de biochimie médicale et de biophysique, Karolinska Institutet, Stockholm, Suède

Petra Kukanja, Eneritz Agirre, Marek Bartosovic & Gonçalo Castelo-Branco

Département de pathologie, École de médecine de l'Université de Yale, New Haven, CT, États-Unis

Mingze Dong, Yuval Kluger et Rong Fan

Programme interdépartemental en biologie computationnelle et bioinformatique, Université de Yale, New Haven, CT, États-Unis

Mingze Dong et Yuval Kluger

Département d'informatique, Université de Princeton, Princeton, NJ, États-Unis

Cong Ma et Benjamin J. Raphaël

Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT et Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Saï Ma

Département de génie biomédical, Columbia University, New York, NY, États-Unis

Yang Xiao et Kam W. Leong

Département de psychiatrie, Columbia University, New York, NY, États-Unis

Gorazd B. Rosoklija, Andrew J. Dwork, J. John Mann et Maura Boldrini

Division d'imagerie moléculaire et de neuropathologie, Institut psychiatrique de l'État de New York, New York, NY, États-Unis

Gorazd B. Rosoklija, Andrew J. Dwork, J. John Mann et Maura Boldrini

Académie macédonienne des sciences et des arts, Skopje, République de Macédoine

Gorazd B. Rosoklija & Andrew J. Dwork

Département de pathologie et de biologie cellulaire, Columbia University, New York, NY, États-Unis

Andrew J.Dwork

Département de radiologie, Columbia University, New York, NY, États-Unis

J. John Mann

Département de biologie des systèmes, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, États-Unis

Kam W. Leong

AtlasXomics, Inc., New Haven, CT, États-Unis

Liya Wang

Institut de génomique, Université de Californie à Santa Cruz, Santa Cruz, Californie, États-Unis

Maximilien Haeussler

Programme de mathématiques appliquées, Université Yale, New Haven, CT, États-Unis

Yuval Kluger

Centre Ming Wai Lau de médecine réparatrice, Stockholm Node, Karolinska Institutet, Stockholm, Suède

Gonçalo Castelo Branco

Programme d'immunologie humaine et translationnelle, Yale School of Medicine, New Haven, CT, États-Unis

Ventilateur Rong

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RF a conceptualisé l'étude. DZ, YD et YL étaient responsables de la méthodologie. DZ et YD ont mené l'enquête expérimentale. DZ, YD, PK, EA, M. Bartosovic, MD, CM, SM, BJR, YK, GC-B. et RF étaient responsables de l'analyse des données. PK, GS, SB, YX, KWL, GBR, AJD, JJM et M. Boldrini étaient responsables de l'obtention des ressources. LW et MH étaient responsables du navigateur de données. DZ, YD et RF ont rédigé le projet original. Tous les auteurs ont révisé, édité et approuvé le manuscrit.

Correspondance à Yanxiang Deng, Gonçalo Castelo-Branco ou Rong Fan.

RF, DZ et YD sont les inventeurs d'une divulgation provisoire de brevet liée à ce travail. RF est le fondateur scientifique et conseiller d'IsoPlexis, Singleron Biotechnologies et AtlasXomics. Les intérêts de RF ont été examinés et gérés par le bureau du prévôt de l'Université de Yale conformément aux politiques de l'université en matière de conflits d'intérêts. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Steven Henikoff, Erica Scott et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, flux de travail schématique de spatial-ATAC-RNA-seq et spatial-CUT&Tag-RNA-seq. b – c, flux de travail de chimie de l'ATAC (b) et de l'ARN (c) dans spatial-ATAC-RNA-seq. d–e, Workflow de chimie de CUT&Tag (d) et ARN (e) dans spatial-CUT&Tag-RNA-seq.

a, image H&E d'une coupe de tissu adjacente d'embryon de souris E13. b, Cartographie spatiale de GAS et expression génique pour des gènes marqueurs sélectionnés dans spatial-ATAC-RNA-seq. c, Intégration des données scRNA-seq12 d'embryons de souris E13.5 avec des données ATAC et ARN dans ATAC-RNA-seq spatial. MOCA, Atlas cellulaire de l'organogenèse de la souris. d, cartographie spatiale des types de cellules identifiés par transfert d'étiquette de scRNA-seq12 à ATAC (en haut) et ARN (en bas). e, visualisation de la piste génomique des gènes marqueurs avec des liens pic à gène pour les éléments régulateurs distaux et la co-accessibilité des pics. f, le niveau d'expression et le pourcentage de pixels dans tous les clusters (gènes marqueurs pour chaque cluster) pour les données d'ARN dans spatial-ATAC-RNA-seq. g, Dot plot montrant l'identification des régulateurs TF positifs. h, Cartographie spatiale des scores de déviation pour les motifs TF sélectionnés. i, Annotation des pics de marqueurs dans différents clusters. j, GRANDE analyse d'enrichissement des pics de marqueurs dans différents clusters (Tests binomiaux et hypergéométriques).

a, analyse d'enrichissement GO pour les gènes de la Fig. 1g. b,c, Analyse pseudo-temporelle de la glie radiale aux neurones prématurés postmitotiques avec GAS (b) et expression génique (c). d, analyses Monocle2 montrant différents états en (b). e, Heatmap de différents états le long de la trajectoire pseudo-temporelle. f, analyse GO des gènes dans la boîte rouge de (e) (version unilatérale du test exact de Fisher, la valeur p a été ajustée pour les comparaisons multiples par la méthode Benjamini & Hochberg).

a, Cartographie spatiale des scores d'activité génique et de l'expression génique pour des gènes marqueurs sélectionnés dans spatial-ATAC-RNA-seq. b, visualisation de la piste génomique des gènes marqueurs avec des liens pic à gène pour les éléments régulateurs distaux et la co-accessibilité des pics. c, Cartographie spatiale des types de cellules identifiés par transfert d'étiquettes de scATAC-seq30 aux données ATAC. IT : intralencéphalique. PT : faisceau pyramidal. NP : quasi-en saillie. CT : corticothalamique. L : couche. d, Cartographie spatiale des types de cellules identifiés par transfert d'étiquettes de scRNA-seq32 aux données d'ARN.

a, Régulateurs TF candidats de Sox2, Pax6 et Mobp. Les points en surbrillance sont les TF avec abs (score de régulation) ≥ 1 (échelle −log10)33, tous les autres TF étant affichés en gris (test Z). b, Cartographie spatiale des scores de déviation pour les motifs TF sélectionnés. c, cartes thermiques des liens pic-à-gène dans spatial-ATAC-RNA-seq. d, le nombre de pics significativement corrélés pour chaque gène.

a—c, distribution spatiale et UMAP de tous les clusters pour l'ATAC (a), l'ARN (b) et le regroupement conjoint de l'ATAC et de l'ARN (c) dans spatial-ATAC-RNA-seq pour le cerveau de la souris. Taille de pixel, 20 µm. Barre d'échelle, 1 mm. d, image colorée au Nissl d'une coupe de tissu adjacente de cerveau de souris P21. Barre d'échelle, 1 mm. e, Intégration des données ATAC dans spatial-ATAC-RNA-seq avec les données scATAC-seq30 du cerveau de souris. f, intégration des données d'ARN dans le spatial-ATAC-RNA-seq avec les données de scRNA-seq32 du cerveau de souris. g, Cartographie spatiale de GAS et expression génique pour des gènes marqueurs sélectionnés dans différents clusters pour ATAC et ARN dans spatial-ATAC-RNA-seq.

a, Intégration des données CUT&Tag (H3K4me3) dans spatial-CUT&Tag-RNA-seq avec les données scCUT&Tag (H3K4me3)36 du cerveau de souris. b, Intégration des données d'ARN dans spatial-CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq, spatial-CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq et spatial-CUT&Tag(H3K4me3)-RNA-seq avec des données scRNA-seq32 du cerveau de souris. ce, Intégration des données d'ARN dans spatial-CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq (c), des données d'ARN dans des données spatiales-CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq (d) et des données d'ARN dans spatial-CUT&Tag(H3K4me3)-RNA-seq (e) avec des données scRNA-seq32 du cerveau de souris. f, cartographie spatiale des types de cellules identifiés par transfert d'étiquettes de scRNA-seq32 aux données d'ARN dans spatial-CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq. g, Cartographie spatiale des types cellulaires identifiés par transfert d'étiquettes de scRNA-seq32 à ARN (en haut) et de scRNA-seq32 à CUT&Tag (H3K27ac, en bas) données dans spatial-CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq. h, Cartographie spatiale des types cellulaires identifiés par transfert d'étiquettes de scRNA-seq32 à ARN (en haut) et de scRNA-seq32 à CUT&Tag (H3K4me3, en bas) données dans spatial-CUT&Tag(H3K4me3)-RNA-seq.

ac, Distribution spatiale et UMAP de tous les clusters pour CUT&Tag (H3K27ac) (a), ARN (b) et regroupement conjoint de CUT&Tag (H3K27ac) et ARN (c) dans spatial-CUT&Tag-RNA-seq pour le cerveau de souris. Taille de pixel, 20 µm. Barre d'échelle, 1 mm. d, image colorée au Nissl d'une coupe de tissu adjacente de cerveau de souris P21. Barre d'échelle, 1 mm. e, Intégration des données CUT&Tag (H3K27ac) dans spatial-CUT&Tag-RNA-seq avec les données scCUT&Tag (H3K27ac)37 du cerveau de souris. f, Intégration des données d'ARN dans spatial-CUT&Tag-RNA-seq avec les données de scRNA-seq32 du cerveau de souris.

ag, Cartographie spatiale de CSS, GAS et expression génique de Mal (a), Mag (b), Car2 (c), Grin2b (d), Syt1 (e), Gpr88 (f) et Ptprz1 (g) à partir d'ATAC et d'ARN dans spatial-ATAC-RNA-seq, et CUT&Tag (H3K27me3, H3K27ac ou H3K4me3) et d'ARN dans spatial-CUT&Tag-RNA-se Q. h, Cartographie spatiale de CSS et expression génique de Nav3, Sncb, Ablim2 et Gng7 dans spatial-CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq.

a, Cartographie spatiale des types de cellules identifiés par transfert d'étiquettes de scRNA-seq43 aux données d'ARN dans spatial-ATAC-RNA-seq pour l'hippocampe humain. b, Dot plot montrant l'identification des régulateurs TF positifs. c, Cartographie spatiale des scores de déviation pour les motifs TF sélectionnés dans spatial-ATAC-RNA-seq.

Fig. supplémentaires. 1–14, tableaux 2–7 et statistiques et reproductibilité.

Une liste d'annotations de type cellulaire dans le cerveau de la souris.

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Zhang, D., Deng, Y., Kukanja, P. et al. Co-profilage spatial épigénome-transcriptome des tissus de mammifères. Nature 616, 113-122 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05795-1

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Reçu : 06 juin 2022

Accepté : 03 février 2023

Publié: 15 mars 2023

Date d'émission : 06 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-05795-1

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